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雷火亚洲电竞平台官网-人胰腺癌细胞的培养操作与应用及研究动态!

2023-09-27


1、布景人胰腺癌细胞来自一个胰腺癌病人的腹水中的细胞移植到裸鼠后成立了这个细胞株。在本库经由过程支原体检测。人胰腺癌细胞经由过程STR检测。可以表达CEA,人胰腺相干抗原、人胰腺特异性抗原和黏卵白。2、人胰腺癌细胞培育操作1)苏醒人胰腺癌细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手4mL培育基雷火电竞网站官网夹杂平均。在1雷火电竞网站官网入口000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育基后吹匀。然后将所有细胞悬液插手培育瓶中培育留宿(或将细胞悬液插手10cm皿中,插手约8ml培育基,培育留宿)。第二天换液并查抄细胞密度。2)人胰腺癌细胞传代:假如细胞密度达80%-90%,便可进行传代培育。1.弃去培育上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)在培育瓶中,置在37℃培育箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落,敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后加少许培育基终止消化。3.按6-8ml/瓶补加培育基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育液后吹匀。4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培育基的新皿中或瓶中。3)细胞冻存:待细胞发展状况杰出时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;1.人胰腺癌细胞冻存时,弃去培育基后,PBS清洗一遍后插手1ml胰酶,细胞变圆脱掉队,插手1ml含血清的培育基终止消化,可以使用血球计数板计数。2.4 min 1000rpm离心去失落上清。加1ml血清重悬细胞,按照细胞数目插手血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低在1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,留意冻存管做好标识。3.将冻存管置在法式降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时今后转入液氮灌贮存。记实冻存管位置以便下次拿取。3、利用人胰腺癌细胞可以用在SPINK1慢病毒过表达载体和其稳转AsPC-1细胞株的构建和其对人胰腺癌细胞增殖的影响:建造包括人SPINK1基因的完全编码区序列的慢病毒过表达载体,用此载体传染人胰腺癌AsPC-1细胞,并成立SPINK1过表达的稳转AsPC-1细胞株,以此来摸索此基因在胰腺癌细胞中是不是具有增进肿瘤细胞增殖和克隆构成的能力,并为此后进一步的研究奠基根本。方式:起首构建SPINK1慢病毒过表达载体,包装病毒并发生病毒颗粒。利用PCR方式扩增SPINK1基因的全数编码序列,经琼脂糖凝胶电泳判定准确后切胶收受接管DNA,将其与慢病毒载体(pLenti-CMV-2A-GFP)同时用限制性内切酶酶切后,用T4 DNA毗连酶进行毗连,将构建好的人SPINK1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-hSPINK1-2A-GFP)进行转化,提取DNA进行酶切后,经由过程琼脂糖凝胶电泳和基因测序进行判定。用已判定准确的SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装夹杂质粒共转染293T细胞发生病毒颗粒,过滤并高速离心浓缩病毒颗粒。然后用此病毒颗粒传染并成立SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株,利用嘌呤霉素(2ug/ml)药物挑选病毒传染后的阳性克隆并扩增,培育成SPINK1过表达稳转AsPC-1细胞株。经由过程及时荧光定量PCR(Real-time PCR)和Western Blot的方式检测病毒传染后SPINK1基因在mRNA程度与卵白程度上的表达转变。最后用CCK-8法、台盼蓝染色法、流式细胞仪检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力的影响,并经由过程平板细胞克隆构成尝试来检测SPINK1基因对人胰腺癌AsPC-1细胞克隆构成能力的影响。成果:经酶切、琼脂糖凝胶电泳尝试和基因测序判定,证实SPIN雷火app官网下载K1慢病毒过表达载体(pLenti-CMV-h SPINK1-2A-GFP)构建准确。SPINK1慢病毒过表达载体和慢病毒包装夹杂质粒共转染293T细胞后,在荧鲜明微镜下可不雅察到很多绿色荧光点,并伴随漂浮细胞和分裂细胞,传染效力可达90%。用慢病毒颗粒传染AsPC-1细胞,经嘌呤霉素药物挑选出阳性克隆,将阳性克隆持续培育扩增数代后经Real-time PCR和Western Blot的方式检测,SPINK1基因可在AsPC-1细胞中不变高效地表达,与阴性对比比拟病毒传染后的SPINK1基因在mRNA程度与卵白程度上的表达量别离上调了25倍和5倍。在CCK-8尝试中,SPINK1过表达AsPC-1细胞的光密度值为1.4 OD,对比组细胞的光密度值为1.0 OD,差别有统计学意义(P<0.001);台盼蓝染色检测细胞活性的尝试发现,SPINK1过表达AsPC-1细胞的活性为(93.30±0.40)%,对比组细胞活性为(71.97±0.78)%,差别有统计学意义(P<0.001);流式细胞仪检测细胞周期的尝试中,SPINK1过表达AsPC-1细胞处在DNA合成期(S期)和DNA合成后期/割裂期(G2/M期)的DNA百分比为38.89%,与其对比的亲本AsPC-1细胞百分比为22.02%,差别有统计学意义(P<0.001);平板细胞克隆构成尝试发现SPINK1基因上调的AsPC-1细胞克隆构成率为(9.70±0.66)%,对比的亲本细胞克隆构成率为(1.23±0.31)%,差别有统计学意义(P<0.001)。北京百欧博伟生物手艺有限公司具有对菌种、细胞、培育基、配套试剂等产物需求者的极优良办事,对采办项目标前期资料供给,中期合同包管,后期货色跟踪到终究售后简直保项目正确到位,都有相干人士进行保护,确保您在微生物菌种查询网中取得最优良办事!也正由于此,北京百欧博伟生物手艺有限公司与国表里多家研制单元、生物制药、第三方检测机构和科研院所院校、化工企业有着杰出、持久和不变的合作关系!下载附件-雷火电竞网站



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