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雷火亚洲电竞平台官网-THLE-2人肝永生化贴壁细胞系的应用及相关研究!

2023-09-28


1、布景THLE-2人肝长生化贴壁细胞系是正常肝细胞用SV40年夜T抗原转染获得。将含有SV40 T抗原的Bgl I-Hpa I片断的逆转录病毒载体导入兼嗜性包装细胞株PA317中出产病毒。THLE-2 and THLE-3表达正常成人肝上皮细胞特点性的表型。当打针到无胸腺裸鼠中时,它们不成瘤,具有接近二倍体的核型,不表达甲胎卵白。2、THLE-2细胞人肝长生化细胞培育操作1)苏醒THLE-2人肝长生化贴壁细胞系细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手4mL培育基夹杂平均。在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育基后吹匀。然后将所有细胞悬液插手培育瓶中培育留宿(或将细胞悬液插手10cm皿中,插手约8ml培育基,培育留宿)。第二天换液并查抄细胞密度。2)THLE-2人肝长生化贴壁细胞系细胞传代:假如细胞密度达80%-90%,便可进行传代培育。1.弃去培育上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)在培育瓶中,置在37℃培育箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落,敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后加少许培育基终止消化。3.按6-8ml/瓶补加培育基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育液后吹匀。4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培育基的新皿中或瓶中。3)THLE-2人肝长生化贴壁细胞系细胞冻存:待细胞发展状况杰出时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;1.细胞冻存时,弃去培育基后,PBS清洗一遍后插手1m雷火亚洲电竞平台官网l胰酶,细胞变圆脱掉队,插手1ml含血清的培育基终止消化,可以使用血球计数板计数。2.4 min 1000rpm离心去失落上清。加1ml血清重悬细胞,按照细胞数目插手血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低在1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,留意冻存管做好标识。3.将冻存管置在法式降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时今后转入液氮灌贮存。记实冻存管位置以便下次拿取。3、利用THLE-2人肝长生化贴壁细胞系可以用在三氯乙烯引诱人肝细胞恶性转化的效应和机制研究:三氯乙烯(Trichloroethylene,TCE)是一种出产情况中常见的有机污染物,属在人类Ⅰ类致癌物。以人长生化肝细胞为模子,研究TCE引诱细胞恶性转化效应和其潜伏机制,并按照挑选的靶份子设计合成新型姜黄素衍生物B5,进一步切磋B5对恶性转化的逆转结果,有望为TCE职业表露预防与节制供给理论根本。研究方式人长生化THLE-2表露在5 mMTCE培育30代,取得THLE-2-TCE细胞。细胞程度研究细胞形态学、发展动力学、增殖迁徙能力和基因组差别;动物程度不雅察THLE-2-TCE异种移植在BALB/c裸鼠后的成瘤潜力、新生物组织病理学和份子生物学(cytokeratin和Ki-67)。随后经由过程氧化应激按捺剂N-乙酰半胱氨酸(N-Ace雷火app官网tyl-L-cysteine,NAC)来切磋氧化应激的生成和其对细胞恶性转化进程的调控感化;在此根本上,连系Label free定量成果,采取通路卵白按捺剂和si-RNA慢病毒干扰等手艺探讨TCE引诱细胞恶性转化的可能份子机制。最后,按照挑选的份子机制靶点(AKT、NFκB),操纵孪药设计的化学方式合成新型姜黄素衍生物B5,经由过程份子对接和份子动力学摹拟,综合评估B5逆转细胞恶性转化的效应并再次验证所挑选的靶份子机制。研究成果(1)THLE-2-TCE细胞恶性转化相干生物学表征:(1)形态学表征:THLE-2-TCE细胞部门堆叠发展,细胞巨细纷歧,呈长梭形且有长长的崛起,可见多核大小胞,细胞形态异化较着。(2)生物功能表征:THLE-2-TCE细胞倍增时候(49.92±0.49 h)较对比组(75.06±1.71 h)较着缩短;克隆增殖能力加强;细胞24 h平均迁徙率(76.67%)、穿膜细胞数量(525.00±13.04个)较着高在对比组(20.83%和114.00±6.78个),以上差别具有统计学意义(P<0.05)。(3)生物表型改变:Label free卵白定量成果显示THLE-2-TCE细胞基因组不不变。细胞增殖分化、迁徙侵袭和抗凋亡正相干卵白(IGF2R、EIF4EBP1、FAM195B、ZNF185、BCAT1等)表达显著升高;原癌基因(AKAP8、BCL2L1、AXL、JUND、AKT2等)高表达,而雷火app官网下载抑癌基因(BCAR1、SAMD9、BCAR3、NFXL1、UIMC1等)表达显著下降。差别卵白功能首要富集在物资间(如卵白质、核酸、生物酶和杂环化合物等)的连系反映;氧化磷酸化、细胞存活和细胞周期等旌旗灯号收集的共性通路,如TGFβ1/SMAD、MAPK、PI3K/AKT/m TOR和NFκB等通路异常活化。综合以上阐发成果,注解THLE-2-TCE细胞具有恶性转化相干生物学活性。(4)裸鼠成瘤尝试:传代对比THLE-2细胞没有构成新生物,THLE-2-TCE细胞新生物构成率为40.00%,终点体积为406.17±76.98 mm3,HE染色显示细胞形态不法则,核深染,且异型较较着,但不和Hep G2阳性对比组显著。cytokeratin染色阳性,系上皮细胞来历。Ki-67阳性细胞比例较高,细胞增殖能力强。THLE-2-TCE细胞裸鼠荷瘤模子的成立,注解该细胞具有必然的体内成瘤潜能。(2)THLE-2-TCE细胞恶性转化潜伏份子机制:(1)TCE染毒进程中,THLE-2细胞内ROS、gp91 phox mRNA转录和卵白程度均升高。MDA、SOD程度增添。KEAP1表达延续下降,而Nrf2和HO-1表达上调,注解抗氧化系统被激活。NAC预处置的细胞迁徙率(32.33±6.13%)、侵袭数(352.00±41.41个)和克隆构成率(230.67±12.04%),别离低在TCE引诱组(47.67±6.13%)、(644.00±39.23个)和(484.00±16.57%)。裸鼠成瘤尝试中,NAC预处置构成瘤率为20.00%,低在TCE引诱组(40.00%),且新生物发展速度、终点体积(173.54±26.39 mm3)和Ki-67阳性细胞数都不和TCE引诱组。(2)卵白质定量和KEGG阐发发现THLE-2-TCE细胞TGFβ、AKT、NFκB等份子显著上调。NFκB si RNA细胞克隆构成、侵袭和迁徙能力下降,增殖卵白cyclin D1表达增添。另外,AKT按捺剂MK-2206和TGFβR按捺剂LY364947处置后,THLE-2-TCE细胞内AKT和NFκB的表达较着下调。TGFβ1刺激后THLE-2细胞内AKT和NFκB表达呈浓度依靠性上调。NAC预处置按捺TGFβ/AKT/NFκB通路活化。以上成果注解ROS可能经由过程调控TGFβ/AKT/NFκB旌旗灯号轴介入TCE引诱的恶性转化。北京百欧博伟生物手艺有限公司的微生物菌种查询网供给微生物菌种收藏、测序、采办等办事,是中国微生物菌种收藏中间的办事平台,而且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培育基为一体的年夜型微生物查询类网站,自设装备和手艺的微生物菌种收藏中间!接待泛博客户来询!下载附件-雷火电竞网站



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