EN

新闻检索

雷火亚洲电竞平台官网-NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞的培养步骤与应用!

2023-11-06


1、布景NIH3T3小鼠胚胎成纤维细胞是1962年Todaro G和Green H从分手的瑞士小鼠胚胎中成立的;该细胞的发展受接触性按捺,会合状况的单层细胞密度为40000个细胞/平方厘米;检测成果显示该细胞鼠痘病毒阴性;在塑料瓶中发展较好,在某些玻璃概况上可能状况欠安;细胞发展饱和时其密度可以到达约50000 cells/cm2。2、培育步调1)苏醒细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手5mL培育基夹杂平均。在1000RPM前提下离心5分钟,弃去上清液,补加4-6mL完全培育基后吹匀。然后将所有细胞悬液插手培育瓶中培育留宿(或将细胞悬液插手6cm皿中),培育留宿。第二天换液并查抄细胞密度。2)细胞传代:假如细胞密度达80%-90%,便可进行传代培育。1.弃去培育上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1-2ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)在培育瓶中,置在37℃培育箱中消化1-2min,然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落,敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后加5ml以上含10%血清的完全培育基终止消化。3.轻轻奏乐细胞,完全脱掉队吸出,在1000RPM前提下离心8-10分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育液后吹匀。4.按5-6ml/瓶补加培育液,将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含5-6 ml培育液的新皿中或瓶中。3、利用用在miR-342-5p在Zmpste24缺掉小鼠胚胎成纤维细胞衰老和DNA毁伤反映中的感化研究:miR-342-5p在Zmpste24缺掉小鼠胚胎成纤维细胞衰老中的感化目标:切磋miR-342-5p在Zmpste24-/-早老症模子小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)衰老表型中的感化机制。方式:(1)经由过程及时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q雷火电竞下载RT-PCR)检测miR-342-5p在Zmpste24-/-早老模子MEFs、复制性衰老的MEFs、H2O2引诱细胞衰老的MEFs和心理性衰长幼鼠组织中的差别表达。(2)在Zmpste24-/-MEFs中瞬时转染m雷火app下载官网iR-342-5p摹拟物(miR-342-5p Mimics,342M),研究过表达miR-342-5p后对Zmpste24-/-MEFs细胞表型的影响:a.经由过程衰老相干β-半乳糖苷酶染色尝试检测细胞衰老;b.经由过程MTT法测定细胞发展曲线和EdU掺入尝试检测细胞增殖;c.经由过程流式细胞术检测细胞周期和卵白印迹尝试检测细胞周期调控卵白。同时,在野生型(wild-type,WT)MEFs中转染miR-342-5p按捺物(miR-342-5p Inhibitor,342I),进行平行对比尝试。(3)靶基因判定:起首经由过程microRNA(miRNA)靶基因猜测软件遴选miR-342-5p潜伏的候选靶基因,再将候选靶基因3′非翻译区(3′-untranslated regions,3′-UTR)包括miR-342-5p连系位点的部门序列(最少500 bp)克隆到pGL3-MCS荧光素酶陈述质粒中,经由过程双荧光素酶尝试验证miR-342-5p可否与候选靶基因3′-UTR相连系,最后采取卵白印迹尝试检测候选靶基因在Zmpste24-/-MEFs中的卵白表达程度是不是受miR-342-5p调控。成果:(1)miR-342-5p在Zmpste24-/-早老症模子MEFs、复制性衰老的MEFs和H2O2引诱细胞衰老的MEFs中的表达均下调。(2)在Zmpste24-/-MEFs中过表达miR-342-5p可以或许下降SA-β-Gal染色细胞比例、增添细胞活力和EdU阳性细胞比例、增添细胞周期G2+M期时比拟例同时上调Cdk1的卵白表达程度。但是,在WT MEFs中按捺miR-342-5p很难不雅察到与Zmpste24-/-MEFs中相反的表型。(3)候选靶基因3′-UTR部门序列成功克隆到p GL3-MCS质粒,双荧光素酶尝试证实miR-342-5p在体外能直接与GAS2基因3′-UTR连系,进一步经由过程卵白印迹尝试证实GAS2基因在Zmpste24-/-MEFs中受miR-342-5p负调控,并发现GAS2在复制性衰老的MEFs和心理性衰长幼鼠肾脏中是上调的。结论:miR-342-5p靶向按捺GAS2并增进Zmpste24-/-MEFs增殖,进而按捺Zmpste24-/-MEFs的细胞衰老表型。切磋miR-342-5p在多柔比星引诱的NIH/3T3细胞DNA毁伤反映中的感化机制。方式:(1)用多柔比星处置NIH-3T3细胞,经由过程q RT-PCR和卵白印迹尝试检测miR-342-5p和DNA毁伤反映相干基因的表达程度。(2)流式细胞术检测miR-342-5p对多柔比星处置的NIH-3T3细胞周期的影响。(3)经由过程miRNA靶基因猜测软件遴选miR-342-5p潜伏的候选靶基因,构建候选靶基因3′-UTR荧光素酶陈述质粒,再经由过程双荧光素酶尝试和卵白印迹尝试判定候选靶基因。(4)卵白印迹尝试检测miR-342-5p对DNA毁伤反映相干卵白和细胞周期相干调理卵白的影响。成果:(1)miR-342-5p、p53和p21在多柔比星引诱的NIH/雷火app官网3T3细胞DNA毁伤反映中上调。(2)过表达miR-342-5p能增进NIH/3T3细胞的G1/S期时相转换并上调Cyclin A2的表达,但是按捺miR-342-5p很难对NIH/3T3细胞周期发生相反的效应。(3)靶基因猜测软件阐发注解Cdkn1a是miR-342-5p的潜伏靶基因,双荧光素酶尝试成果注解miR-342-5p能与Cdkn1a 3′-UTR直接连系,卵白印迹尝试成果注解过表达miR-342-5p能下调Cdkn1a基因产品p21卵白程度,同时上调p Rb与Cdk1的卵白程度。微生物菌种查询网自设细胞系板块,是细胞株供给中间,专业供给代次低、周期短、活性好的细胞株。与国表里多家研制单元,生物医药,第三方检测机构,科研院所有着杰出不变的持久合作关系!接待泛博客户来询!下载附件-雷火电竞网站



上一篇:雷火亚洲电竞平台官网-单核增生李斯特菌的致病性与传播途径及预防与治疗!
下一篇:雷火亚洲电竞平台官网-不动杆菌属的流行病学与临床表现及实验室检验!
返回列表页
客服系统