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雷火亚洲电竞平台官网-MLE-12小鼠肺上皮细胞的培养操作与应用!

2023-11-07


1、布景MLE-12小鼠肺上皮细胞 是由Kathryn A.Wikenheiser在1992年在转基因鼠体内成立,经由过程人概况活性卵白C基因启动子区调控的SV40年夜T抗原在小鼠体内构成肺肿瘤。细胞抗原表达: HLA A11,B15,B17,Cw1,Cw3;blood type B,细胞致癌基因:myc+;myb+;ras+;fos+;p53+;sis-;abl-;ros-;src-细胞基因表达: 肺概况活性物资卵白B和C(SP-B,SP-C),并且该细胞可以或许引诱癌细胞发生。2、小鼠肺上皮细胞株培育操作1)苏醒细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中敏捷摇摆解冻,插手4mL培育基夹杂平均。在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育基后吹匀。然后将所有细胞悬液插手培育瓶中培育留宿(或将细胞悬液插手10cm皿中,插手约8ml培育基,培育留宿)。第二天换液并查抄细胞密度。2)细胞传代:假如细胞密度达80%-90%,便可进行传代培育。1.弃去培育上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)在培育瓶中,置在37℃培育箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下不雅察细胞消化环境,若细胞年夜部门变圆并脱落,敏捷拿回操作台,轻敲几下培育瓶后加少许培育基终止消化。3.按6-8ml/瓶补加培育基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM前提下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培育液后吹匀。4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培育基的新皿中或瓶中。3、利用用在卵白酪氨酸磷酸酶Shp2在卷烟引诱肺纤维化中的调理感化研究切磋按捺和基因敲除Shp2减轻抽烟引诱小鼠肺纤维化的感化和机制。方式:1、整体尝试:不雅察Shp2特异性按捺剂PHPS1干涉干与和肺上皮细胞Shp2基因敲除小鼠对抽烟引发的肺纤维化指标的影响。小鼠天天抽烟10支,持续10天,引诱肺纤维化模子,检测指标包罗转录发展因子β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)、基质金属卵白酶-9(Matrix metalloproleinase-9,MMP-9)、钙连系卵白(Calcium binding protein,S100A4),胶原纤维沉积和Shp2表达。1)搜集肺泡灌洗液(BALF),采取酶联免疫吸附(Elisa)法检测BALF上清中MMP-9和TGF-β1卵白表达;2)搜集肺组织,制备匀浆上清液,采取定量多聚合酶链反映(Q-PCR)法测定匀浆上清液中MMPs和TGF-β1基因的表达;3)建造肺组织切片,采取免疫组化染色法检测吝啬道四周Shp2、MMP-9和S100A4表达;4)肺组织切片,采取Masson胶原纤维染色法检测吝啬道四周胶原纤维沉积。2、离体尝试:不雅察Sh雷火app官网p2特异性按捺剂PHPS1处置肺上皮细胞和Shp2基因缄默肺上皮细胞对CSE引诱的MMP-9和TGF-β1表达的影响,和对旌旗灯号份子的影响。卷烟烟雾提取物(CSE)刺激小鼠正常肺上皮细胞MLE-12:1)采取MTT法测定MLE-12细胞活性;2)Western blot(WB)法检测CSE引诱p-Shp2和Shp2表达;3)CSE刺激MLE-12细胞,Q-PCR法检测MMPs基因表达,WB法检测MMP-9卵白表达;4)Shp2特异性按捺剂PHPS1干涉干与细胞落后雷火电竞网站官网入口行CSE刺激,采取Q-PCR和WB法检测Shp2对CSE引诱MMP-9基因和卵白的影响。4、验收细胞留意事项1、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12,请查看瓶子是不是有分裂,培育基是不是漏出,是不是混浊,若有请尽快联系。2、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12,如包装无缺,请在显微镜下不雅察细胞。,因为运输进程中的问题,细胞培育瓶中的贴壁细胞有可能从瓶壁中脱落下来,显微镜下不雅察会呈现细胞悬浮的环境,呈现此状况时,请不要打开细胞培育瓶,应当即将培育瓶置在细胞培育箱里静止3-5小时摆布,让细胞先不变下,再在显微镜下不雅察,此时大都细胞会从头贴附在瓶壁。如细胞仍不克不及贴壁,请用台盼蓝染色法判定细胞活力,如台盼蓝染色证实细胞活力正常请按悬浮细胞的方式处置。3、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12后,请镜下不雅察细胞,用得当体例处置细胞。若悬浮的细胞较多,请离心搜集细胞,接种到一个新的培育瓶中。弃失落原液,利用新颖配制的培育基,利用进口胎牛血清。刚接到细胞,若细胞不多时血清浓度可以加到15%去培育。若细胞迏到80%摆布,血清浓度仍是在10%。4、收到小鼠肺上皮细胞MLE-12时如无异常环境,请在显微镜下不雅察细胞密度,如为贴壁细胞,未跨越80%会合度时,将培育瓶中培育基吸出,留下5-10ML培育基继续培育:跨越80%会合度时,请按细胞培育前提传代培育。如为悬浮细胞,吸出培育液,1000转/分钟离心3分钟,吸出上清,管秘闻胞用新颖培育基悬浮细胞后移回培育瓶。5、将培育瓶置在37℃培育箱中培育,盖子微微拧松。吸出的培育基可以保留在灭菌过的瓶子里,寄存在4℃冰箱,以备不时之需。6、24小时后,小鼠肺上皮细胞MLE-12恢复并贴满瓶壁,便可传代。(贴壁细胞)将培育瓶里的培育基倒去,加3-5ml(以能笼盖细胞发展面为准)PBS或Hanks’液洗涤后弃去。加0.5-1ml 0.25%含EDTA的胰酶消化,消化时候以具体细胞为准,一般1-3分钟,不跨越5分钟。可以放入37℃培育箱消化。轻轻晃悠瓶壁,见细胞脱落下来,插手3-5ml培育基终止消化。用移液管轻轻奏乐瓶壁上的细胞,使之完全脱落,然后将溶液吸入离心管内离心,1000rpm/5min。弃上清,视细胞数目决议分瓶数,一般一传二,如细胞量多可一传三,有些细胞不容易传得过稀,有些发展较快的细胞则可以多传几瓶,以具体细胞和经验为准。(悬浮细胞)用移液管轻轻奏乐瓶壁,直接将溶液吸入离心管离心便可。7、贴壁细胞,悬浮细胞。严酷无菌操作。换液时,换新的细胞培育瓶和换新颖的培育液,37℃,5%CO2培育。特殊提示:原瓶中培育基不宜继续利用,请改换新颖培育基培育。北京百欧博伟生物手艺有限公司的微生物菌种查询雷火亚洲电竞平台官网网供给微生物菌种收藏、测序、采办等办事,是中国微生物菌种收藏中间的办事平台,而且是集微生物菌种、菌种,ATCC菌种、细胞、培育基为一体的年夜型微生物查询类网站,自设装备和手艺的微生物菌种收藏中间!接待泛博客户来询!下载附件-雷火电竞网站



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